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讲授内容

注解

第五章体外分析技术

体外放射配体结合分析---指在体外条件下,以放射性核素标记的配体为示踪剂,以结合反应为基础,以放射性测量为定量手段,对微量活性物质进行定量分析的一类检测技术的总称。

     第一节 放射免疫分析的基本原理

一、定义:是利用标记抗原和非标记抗原竞争结合其特异抗体,给予充分的时间,使反应达到平衡,然后分离并分别测定结合的抗原抗体复合物放射性(B)和游离抗原放射性(F)来计算出非标记抗原含量的一种超微量分析技术。

二、基本原理:

最具代表性的一类检测技术,是建立在抗原抗体结合的高度特异性和放射性测量的高度灵敏性的基础上的。

              Ag Ab   AgAb

                    

                    *Ag   *AgAb

   动态平衡体系中,*AgAg具有同样的免疫活性和结合反应能力,当*AgAb的量恒定,且Ag+ *Ag的分子数〉抗体的分子数 *AgAg相互竞争同Ab结合,彼此抑制,待测Ag*AgAb呈负相关函数关系。

 

第二节放射免疫分析法的建立和基本试剂

一、基本试剂

(一)标记抗原*Ag的质量要求:

1.        标记后不改变原有抗原的生物活性;

2.        标记的放射性核素的t1/2不能太短;

3.        比活度和放化纯度足够高,保证分析的灵敏度。

(二)标准抗原(标准品)

1.        是已知含量并呈梯度浓度的系列标准抗原,作标准曲线用。

2.        要求:

      保证与被测物具有相同的免疫活性和相同介质。

(三)抗体

1.        RIA使用:多克隆抗体和单克隆抗体

2.        衡量抗体质量的指标是:亲和力、特异性和滴度:

二、            操作过程

1.          配制已知浓度系列标准抗原(Ag---现多由厂家提供已配置好的标准品

2.          加待测抗原(Ag)和抗体(Ab--温育

3.          加标记抗原(*Ag)和抗体(Ab--温育

4.          分离复合物*AgAbB)和游离*AgF

5.          γ计数器测量放射性计数

6.          根据标准曲线或计算机直接算出

 

第三节分离方法和数据处理

一、目的:将游离*Ag *AgAb有效分离。

二、分离方法:

1.        收集游离抗原测量放射性:活性炭吸附法

2.        收集抗原抗体复合物测量放射性:固相法和沉淀法(葡萄球菌A蛋白、聚乙二醇、双抗体法)

3.        Ab:固相法

三、数据处理:

1.        手工作图

2.        计算机数据处理

 

第四节质量控制

一、目的: 保证分析误差控制在可接受的范围内

二、分类: 实验室内部质控和实验室间质控

三、误差的来源

1、系统误差:表现为结果呈倾向性偏高或偏低。常见因素方法误差:如标准品稀释不正确,分离效果不好等仪器和试剂:仪器状态、量器、试剂纯度等操作误差:操作习惯、加错样品等。通过努力系统误差可以消除。

2、随机误差:表现为某一管或某一部分样本的结果误差随机的、偶然的,小误差的概率大。常由操作者操作不当造成。

四、质量控制的指标

1、稳定性:指RIA实验批间的重复性。

常用指标有:

1)          零标准管结合率(B0%):一般要求在30-50%

2)          非特异性结合率(NSB%):一般要求<5-10%

3)          标准曲线直线回归的参数

4)          ED25 ED50 ED75

2、精密度:是对某一样品多次检测所得结果的符合程度。即复管的重复性。是最重要的质量参数。

3、灵敏度:方法的最小可测值。计算方法是累计多批(一般10次)测量结果,计算出零标准管的结合率为x2SD时对应的剂量值。

4、准确度:是指测量值与真值的接近程度。评价方法从回收率、质控样品和健全性三方面评价。

 

第五节免疫放射分析法

一、定义:

免疫放射分析法是以125I标记抗体,用过量的标记抗体与待测抗原形成复合物,分离除去多余的游离抗体,测量抗原抗体复合物的放射性。

二、基本原理:

放射性标记的是抗体而不是抗原,且抗原与过量的标记抗体结合反应,故反应是非竞争性的全量反应。

三、常用方法:夹心法和标记第三抗体法。

四、特点:

1、优点:灵敏度较放免法。

2、局限性:至少需要两个抗体;对缓冲液PH及离子强度的要求较为严格;待测抗原的量太大时,易出现倒钩现象。

 

第六节非放射性标记免疫分析技术

一、酶标记免疫分析技术

1定义:酶分子代替放射性核素标记抗原或抗体分子,利用酶促作用使底物反应,利用酶使底物显色的作用而使酶的作用得到放大,进行竞争性或非竞争性免疫分析的技术。

2、应用最多和最有发展前途的方法:酶联免疫吸附分析法(ELISA

3、常用的酶:辣根过氧化物酶(HRP

4、常用的底物:

       四甲基联苯胺(TMB),反应后显黄色

       氨基水杨酸(5-AS),        棕色

5、常用方法:固相测定法

6、测定方式:分光光度计

7、化学发光酶免疫测定(CLIEA)抗原抗体反应步骤均与酶免疫测定相同,不同之处是酶反应所用底物为发光剂发。

二、            化学发光免疫分析技术

(一)化学发光免疫分析

1、用能产生化学发光的化合物代替放射性标记物,其余类似RIAIRAM.

2、发光化合物:异鲁米那  甲基氮蒽

3、缺点:发光时间集中在加入过氧化物或碱的短时间内,必须严格掌握时间。

(二) 化学发光酶免疫分析(CLEIA

1、标记物:碱性磷酸酶的抗体

2、底物:金刚烷

3、优点:可靠性好

(三)电化学发光免疫(ECLI

标记物:三联吡啶钌

三、时间分辨荧光免疫分析技术

1、镧系元素铕(Eu)铽(Tb)钐(Sm)镝(Dy)并非荧光素,但由于特殊的理化性质,在离子价态时受到紫外光或激光的激发后会以荧光形式发射持续一定时间、一定光峰光谱,而其他非特异荧光寿命短,利用时间分辨可排除背景荧光的干扰。

2、常用方法:双位点夹心法、BAS增强双位点夹心法、相抗原竞争法、固相抗体竞争法

3、优点:提高了灵敏度,不损害样品而可以重复测量或做其他测量;高度自动化。

 

课堂小结:

1RIA的基本原理要点:

*AgAg相互竞争同Ab结合,彼此抑制,待测Ag*AgAb呈负相关函数关系.

2RIA的特点:

«     灵敏度高 

«     特异性强 

«     精确度好

«     稳定性好

«     应用广泛

3、免疫放射分析:放射性标记的是抗体而不是抗原,且抗原与过量的标记抗体结合反应,故反应是非竞争性的全量反应。

4、非放射性标记免疫分析技术:全自动化,有效地解决了大规模临床样本检测的稳定、高效、快速、自动化问题。是医学超微量分析的一次战略性革命。

 

 

 

 

 

理解

放射免疫分析是一划世纪的进步,1977年荣获诺贝尔生物医学奖。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

了解

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

手绘图:

 

 

 

 

了解

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

了解

 

 

 

 

 

 

 

 

 

板书+手绘图:

精确性问题是随机误差问题,而偏差是系统误差问题

 

 

 

 

 

 

 

 

 

了解

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

理解

 

 

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